Рекомбинантен протеин: методи за производство и приложения

Протеинът е основен компонент на всички организми. Всяка молекула се състои от една или повече полипептидни вериги, съставени от аминокиселини. Въпреки че информацията, необходима за живота, е кодирана в ДНК или РНК, рекомбинантните протеини изпълняват широк спектър от биологични функции в организмите, включително ензимен катализ, защита, поддръжка, движение и регулиране. Според функциите си в организма тези вещества могат да бъдат класифицирани в различни категории като антитела, ензими, структурен компонент. Предвид важните им функции, тези съединения са интензивно изучавани и широко използвани.

В миналото основният начин за получаване на рекомбинантен протеин беше изолирането му от естествен източник, което обикновено е неефективно и отнема много време. Неотдавнашният напредък в молекулярната биотехнология направи възможно клонирането на ДНК, кодираща специфичен набор от вещества, във вектор, експресиращ вещества, като например бактерии, дрожди, клетки на насекоми и клетки на бозайници.

Казано по-просто, рекомбинантните протеини се превеждат чрез продукти на екзогенна ДНК в живи клетки. Производството им обикновено се състои от два основни етапа:

1. Клониране на молекули.
2. Изразяване на протеини.

Създаването на такава структура днес е една от най-мощните техники, използвани в медицината и биологията. Съединението има широк спектър от приложения в областта на научните изследвания и биотехнологиите.

Медицинско направление

Рекомбинантните протеини осигуряват важни терапевтични методи различни заболявания, като диабет, рак, инфекциозни заболявания, хемофилия и анемия. Обичайните състави на такива вещества включват антитела, хормони, интерлевкини, ензими и антикоагуланти. Нараства нуждата от рекомбинантни съединения за терапевтични приложения. Те позволяват разширяване на терапевтичните техники.

Рекомбинантните генетично модифицирани протеини играят ключова роля на пазара на терапевтични лекарства. Понастоящем клетките на бозайници произвеждат най-много терапевтични агенти, тъй като техните формули са способни да произвеждат висококачествени вещества, подобни на естествените. Освен това много от одобрените рекомбинантни терапевтични протеини се произвеждат в E. coli поради добрата генетика, бързия растеж и високата производителност. Това има положителен ефект и върху разработването на лекарства на основата на веществото.

Провеждане на изследвания

Производството на рекомбинантни протеини се основава на различни методи. Веществата помагат за изясняване на основните и фундаментални принципи на даден организъм. Тези молекули могат да се използват за идентифициране и локализиране на веществото, кодирано от определен ген, и за разкриване на функцията на други гени в различни клетъчни дейности като клетъчна сигнализация, метаболизъм, растеж, репликация и смърт, транскрипция, транслация и модификация на разглежданите съединения.

Така разгледаните съединения се използват често в молекулярната биология, клетъчната биология, биохимията, структурните и биофизичните изследвания и много други области на науката. Производството на рекомбинантни протеини се практикува на международно ниво.

Такива съединения са полезни инструменти за разбиране на междуклетъчните взаимодействия. Те са доказали ефективността си в няколко лабораторни техники като ELISA и имунохистохимия (IHC). Рекомбинантните протеини могат да се използват за разработване на ензимни тестове. Когато се използват в комбинация с двойка подходящи антитела, клетките могат да се използват като стандарти, за да се прилагат нови технологии.

Биотехнологии

Рекомбинантните протеини, съдържащи аминокиселинната последователност, се използват и в промишлеността, производството на храни, селското стопанство и биоинженерството. Например в животновъдството ензимите могат да се добавят към храната, за да се повиши хранителната стойност на фуражните съставки, да се намалят разходите и отпадъците, да се подпомогне здраве червата на животните, подобряване на производителността и повишаване на околна среда.

Освен това млечнокиселите бактерии (МАБ) отдавна се използват за производство на ферментирали храни, а напоследък МАБ са разработени за експресия на рекомбинантни протеини, съдържащи аминокиселинна последователност, които могат да намерят широко приложение, например за подобряване на храносмилането на хора, животни и хранителни продукти.

Тези вещества обаче имат и ограничения:

1. В някои случаи производството на рекомбинантни протеини е сложно, скъпо и отнема много време.
2. Веществата, произвеждани в клетките, може да не съответстват на естествените им форми. Тази разлика може да намали ефикасността на терапевтичните рекомбинантни протеини и дори да предизвика странични ефекти. Освен това тази разлика може да повлияе на резултатите от експериментите.
3. Основният проблем за всички рекомбинантни лекарства е имуногенността. Всички биотехнологични лекарства могат да проявят някаква форма на имуногенност. Безопасността на новите терапевтични протеини е трудно да се предвиди.

Като цяло напредъкът в биотехнологиите увеличи и улесни производството на рекомбинантни протеини за различни приложения. Въпреки че все още имат някои недостатъци, веществата са важни в медицината, научните изследвания и биотехнологиите.

Връзка с болестта

Рекомбинантният протеин не вреди на човека. Само част от обща молекула при разработването на определено лекарство или хранително вещество. Много медицински изследвания показват, че принудителната експресия на протеина FGFBP3 (съкратено BP3) при лабораторен щам затлъстели мишки води до значително намаляване на мастната им маса, въпреки генетичното им предразположение.

Резултатите от тези изпитвания показват, че протеинът FGFBP3 може да предложи нови терапии за нарушения, свързани с метаболитния синдром, като диабет тип 2 и чернодробно затлъстяване. Но тъй като BP3 е естествен протеин, а не изкуствено лекарство, клиничните изпитвания на рекомбинантния човешки BP3 могат да започнат след последния кръг предклинични проучвания. Наред с това съществуват причини, свързани с безопасността на провеждането на такива изпитвания. Рекомбинантен протеин вреди на Човекът не носи и поради неговата поетапна обработка и пречистване. Промени настъпват и на молекулярно ниво.

PD-L2, един от ключовите играчи в имунотерапията, номиниран за Нобелова награда за физиология и медицина за 2018 г. Тази работа, започната от професор Джеймс П. Алисън от САЩ и проф. Тасуку Хонджо от Япония, е водеща в лечението на ракови заболявания като меланом, рак на белия дроб и други с имунотерапия, базирана на контролни точки. AMSBIO наскоро добави важен нов продукт към своята гама за имунотерапия - PD-L2 / TCR активатор SNO Рекомбинантна клетъчна линия.

В експерименти за доказване на концепцията изследователи от Университета на Алабама в Бирмингам, ръководени от H.Лонг Джън Професор Робърт Б. Адамс и директорът на лабораторията по медицина в катедрата по патология в Медицинския факултет на университета UAB изтъкнаха потенциална терапия за рядко, но смъртоносно заболяване на кръвосъсирването - TTP.

Резултатите от това проучване показват за първи път, че трансфузията на тромбоцити, натоварени с rADAMTS13, може да бъде нов и потенциално ефективен терапевтичен подход за артериална тромбоза, свързана с вроден и имунно-медииран ТТП.

Рекомбинантният протеин е не само хранителна съставка, но и лекарство в разработен състав. Това са само някои от областите, които понастоящем се изследват в медицината и са свързани с изучаването на всички нейни структурни елементи. В международен план е доказано, че структурата на веществото има потенциал да се бори с много сериозни проблеми на молекулярно ниво в човешкото тяло.

Разработване на ваксини

Рекомбинантният протеин е специфичен набор от молекули, които могат да бъдат моделирани. Подобни свойства се използват при разработването на ваксини. Нова стратегия за ваксинация, известна още като използване на специална инжекция с рекомбинантен вирус, може да защити милиони пилета, застрашени от сериозно респираторно заболяване, съобщават изследователи от Единбургския университет и института "Пирбрайт". Тези ваксини използват безвредни или слаби версии на вируса или бактерии за въвеждане на микроби в клетките на тялото. В този случай експертите използват рекомбинантни вируси с различни протеини на шипа като ваксини, за да създадат две версии на безвреден вирус. Има много различни лекарствени продукти изградена върху тази връзка.

Рекомбинантният протеин има следните търговски наименования и аналози:

1. "Fortelisin".
2. "Zaltrap".
3. "Eilea".

Основно противотуморни лекарства, но има и други области на лечение, свързани с тази активна съставка.

Според ново проучване, публикувано в научното списание Nature Communications, нова ваксина, наречена още LASSARAB, предназначена да предпазва хората едновременно от треска Ласа и бяс, е показала обещаващи резултати в предклинични проучвания. Кандидатът за инактивирана рекомбинантна ваксина използва атенюиран вирус на бяс.

Изследователският екип вмъква генетичен материал на вируса Ласа във вектор на вируса на бяс, така че ваксината да изразява повърхностни протеини както в клетките на Ласа, така и в тези на бяс. Тези повърхностни формулировки предизвикват имунен отговор срещу инфекциозни агенти. След това тази ваксина се инактивира, за да се "убие" използваният жив вирус на бяс за производството на превозвача.

Методи на производство

Съществуват няколко системи за производство на веществото. Общият метод за получаване на рекомбинантен протеин се основава на получаването от синтеза на биологичен материал. Но има и други начини.

Понастоящем съществуват пет основни системи за изразяване:

1. E. Coli.
2. Експресионна система за дрожди.
3. Система за изразяване на клетки на насекоми.
4. Клетъчна експресионна система за бозайници.
5. Система за експресия на безклетъчни протеини.

Последният вариант е особено подходящ за експресия на трансмембранни протеини и токсични съединения. През последните години вещества, които трудно се експресират по конвенционалните вътреклетъчни пътища, бяха успешно интегрирани в клетките in vitro. В Беларус производството на рекомбинантни протеини е широко използвано. В този въпрос са замесени редица публични дружества.

Безклетъчният синтез на протеини е бърз и ефективен метод за синтезиране на целеви вещества чрез добавяне на различни субстрати и енергийни състави, необходими за транскрипцията и транслацията в ензимната система на клетъчните екстракти. През последните години постепенно се очертаха предимствата на безклетъчните методи за тези видове вещества, като изтънчен, Токсични, мембранно асоциирани, което показва потенциалното им приложение в биофармацевтичната област.

Безклетъчната технология може лесно и контролирано да добавя разнообразни аминокиселини, които не се срещат в природата, за да постигне сложни процеси на модификация, които са трудни за решаване чрез конвенционална рекомбинантна експресия. Тези методи имат висока стойност за използване и потенциал за доставка на лекарства и разработване на ваксини с помощта на вирусоподобни частици. Голям брой мембранни протеини са успешно експресирани в свободни клетки.

Изразяване на съединението

Рекомбинантният протеин CFP10-ESAT 6 се произвежда и се използва за разработване на ваксини. Този туберкулозен алерген позволява засилване на имунитета и производство на антитела. Най-общо казано, молекулярните изследвания включват изучаване на всеки аспект на даден протеин, като структура, функция, модификации, локализация или взаимодействия. За да изследват как определени вещества регулират вътрешните процеси, изследователите обикновено се нуждаят от средства за производство на функционални съединения, които представляват интерес и полза.

Предвид големината и сложността на протеините, химическият синтез не е подходящ вариант за това начинание. Вместо това живите клетки и техните клетъчни механизми обикновено се използват като фабрики за създаване и конструиране на вещества въз основа на предоставените генетични шаблони. Система за експресия на рекомбинантни протеини, която впоследствие създава необходимата структура за създаване на лекарство. Следващата стъпка е да изберете необходимите материал за различни категории лекарства.

За разлика от белтъците, ДНК може лесно да се конструира синтетично или in vitro, като се използват добре доказани рекомбинантни. Следователно ДНК матриците на специфични гени, със или без добавени репортерни последователности или афинитетно маркирани последователности, могат да бъдат конструирани като матрици за експресия на. Такива състави, получени от такива ДНК матрици, се наричат рекомбинантни протеини.

Традиционните стратегии за експресия на веществото включват трансфекция на клетките с ДНК вектор, който съдържа матрицата, и последващо култивиране на клетките, така че те да транскрибират и транслират желания протеин. Обикновено след това клетките се лизират, за да се извлече експресираното съединение за последващо пречистване. Рекомбинантният протеин CFP10-ESAT6 се обработва по този начин и преминава през система за пречистване срещу евентуално образуване на токсини. Едва след това тя влиза за синтез във ваксина.

Широко се използват както прокариотни, така и еукариотни системи за молекулярна експресия in vivo. Изборът на система зависи от вида на протеина, изискванията за функционална активност и желания добив. Тези експресионни системи включват бозайници, насекоми, дрожди, бактерии, водорасли и клетки. Всяка система има своите предимства и предизвикателства и изборът на правилната система за конкретното приложение е важен за успешното изразяване на веществата, разгледани в тази статия.

Изразяване от бозайници

Използването на рекомбинантни протеини позволява разработването на различни нива на ваксини и лекарства. Този метод за получаване на веществото може да се използва. Системите за експресия на бозайници могат да се използват за производство на протеини от животинския свят, които имат най-близката до естествената структура и активност поради физиологично подходящата им среда. Това води до високи нива на посттранслационна обработка и функционална активност. Системите за експресия на бозайници могат да се използват за производство на антитела, сложни протеини и съединения за използване в клетъчни функционални тестове. Тези предимства обаче, съчетани с по-строги условия за култивиране.

Системите за експресия на бозайници могат да се използват за временно производство на протеини или чрез стабилни клетъчни линии, при които конструкцията за експресия е интегрирана в генома на гостоприемника. Въпреки че такива системи могат да се използват за няколко експеримента, временното производство може да генерира големи количества вещество за една до две седмици. Биотехнологиите за рекомбинантни протеини от този тип се радват на голямо търсене.

Тези преходни, високопроизводителни системи за експресия на бозайници използват суспензионни култури и могат да дават грамажи на литър. Освен това тези белтъци имат по-натурално нагъване и посттранслационни модификации, като например гликозилиране, в сравнение с други системи изрази.

Изразяване от насекомо

Методите за получаване на рекомбинантен протеин не се ограничават до бозайници. Съществуват и по-продуктивни начини по отношение на производствените разходи, въпреки че добивът от 1 литър преработена течност е много по-нисък.

Клетките на насекомите могат да се използват за експресия на протеини на високо ниво с модификации, подобни на тези в системите на бозайниците. Съществуват няколко системи, които могат да се използват за получаване на рекомбинантен бакуловирус, който след това може да се използва за извличане на интересуващото ни вещество от клетките на насекомите.

Експресиите на рекомбинантни протеини могат лесно да бъдат разширени и адаптирани към суспензионни култури с висока плътност за широкомащабно производство на съставни молекули. Функционално те са по-близки до естественото съединение за бозайници. Въпреки че добивът може да достигне до 500 mg/l, производството на рекомбинантен бакуловирус може да отнеме много време, а условията за култивиране да са по-сложни от тези на прокариотните системи. Въпреки това в по-южните и по-топли страни този метод се счита за по-ефективен.

Бактериално изразяване

Производството на рекомбинантни протеини може да се осъществи и с помощта на бактерии. Тази техника е много по-различна от описаните по-горе. Системите за експресия на бактериални протеини са популярни, тъй като бактериите са лесни за култивиране, растат бързо и дават високи добиви на рекомбинантни. Въпреки това многодоменните еукариотни вещества, експресирани в бактерии, често са нефункционални, тъй като клетките не са оборудвани да извършват необходимите посттранслационни модификации или молекулярно нагъване.

Освен това много белтъци стават неразтворими като включващи молекули, които са много трудно се реконструират без агресивни денатуриращи агенти и последващи тромави процедури за повторно сгъване на молекулния състав. В по-голямата си част този метод все още се счита за експериментален.

Изразяване без клетки

Рекомбинантен протеин, съдържащ аминокиселинната последователност на стафилокиназата, се произвежда по малко по-различен начин. Включва се в много видове инжекции, от които се изискват няколко системи преди употреба.

Експресията на безклетъчен протеин е in vitro синтез на вещество чрез използване на транслационно съвместими екстракти от цели клетки. По принцип екстрактите от цели клетки съдържат всички макромолекули и компоненти, необходими за транскрипция, транслация и дори посттранслационна модификация.

Тези компоненти включват РНК полимераза, регулаторни протеинови фактори, форми на транскрипция, рибозоми и тРНК. Когато се добавят кофактори, нуклеотиди и специфична генна матрица, тези екстракти могат да синтезират интересуващите ни протеини за няколко часа.

Въпреки че не са устойчиви за широкомащабно производство, системите за експресия на протеини без клетки или in vitro (IVT) имат няколко предимства пред конвенционалните in vivo системи.

Безклетъчната експресия позволява бърз синтез на рекомбинантни препарати без участие на клетъчна култура. Безклетъчните системи позволяват белтъците да се маркират с модифицирани аминокиселини и да се експресират състави, които се подлагат на бързо протеолитично разграждане от вътреклетъчните протеази. Освен това е по-лесно да се експресират много различни протеини едновременно чрез безклетъчния метод (напр. да се тестват мутации на протеини чрез експресия в малък мащаб от много различни рекомбинантни ДНК матрици). В този представителен експеримент е използвана система IVT за експресия на човешкия протеин каспаза-3.

Заключения и бъдещи перспективи

Производството на рекомбинантни протеини вече може да се счита за зряла дисциплина. Това е резултат от многобройните постепенни подобрения в пречистването и анализа. В днешно време програмите за откриване на лекарства рядко се спират поради невъзможност да се произведе целевият протеин. Паралелните процеси за експресия, пречистване и анализ на няколко рекомбинанта вече са добре установени в много лаборатории по света.

Протеиновите комплекси и нарастващият успех в създаването на разтворими мембранни структури ще изискват повече промени, за да се отговори на търсенето. Появата на ефикасни договорни изследователски организации за по-редовно снабдяване с протеини ще преразпредели научните ресурси за справяне с тези нови предизвикателства.

Освен това паралелните работни процеси трябва да позволяват създаването на пълни библиотеки от разглежданото вещество, за да се идентифицират нови цели и да се подобри скринингът, наред с традиционните проекти за откриване на малки молекули лекарства.